- 服务详情
实验原理
腺病毒是直径约80-120 nm的无包膜的线性双链DNA病毒（见图3.1），可迅速感染分裂和非分裂期细胞，与细胞表面受体结合后通过内吞作用进入细胞，在细胞核孔附近聚集，并在感染后2h将腺病毒的DNA释放到细胞核中并开始蛋白表达。通过对野生腺病毒进行改造，保留包装信号序列，去除病毒蛋白的编码序列，不仅增加外源基因的装载容量，而且降低细胞毒性和机体免疫反应，从而获得安全性更高的基因导入系统。
腺病毒包装系统的特点：不整合到宿主细胞基因组，无插入致突变性；可进行有效扩增，获得高滴度高纯度的腺病毒。
图3.1腺病毒结构示意图
技术应用
体外实验可快速有效地将目的基因或RNAi片段导入靶细胞，研究目的基因功能。
体内实验多应用于疫苗接种、基本治疗研究等。
实验流程
病毒提供规格
腺病毒种类 | 客户提供 | 我们提供的病毒规格 | 提供量 | 赠送阴性对照 | 实验周期 |
过表达腺病毒 | 基因NCBI登陆号及含该基因的质粒载体、测序报告 | 低滴度10^8-10^9 IU/ml | 10ml | 2ml | 6周 |
高滴度10^11-10^12 IU/ml | 1ml | 0.2ml | 9周 | ||
高纯滴度10^11-10^12 IU/ml （推荐用于动物体内实验） | 1ml | 0.2ml | 10周 | ||
干扰腺病毒 | 待干扰基因的NCBI登陆号及靶点序信信息 | 低滴度10^8-10^9 IU/ml | 10ml | 2ml | 7周 |
高滴度10^11-10^12 IU/ml | 1ml | 0.2ml | 10周 | ||
高纯滴度10^11-10^12 IU/ml （推荐用于动物体内实验） | 1ml | 0.2ml | 11周 |
载体图谱
图3.2第一次重组腺病毒中间载体图谱
图3.3第二次重组腺病毒载体图谱
实验结果展示
图3.4过表达腺病毒感染原代大鼠神经元细胞图片及qPCR过表达检测
图3.5腺病毒感染各种细胞图片展示
TROUBLESHOOTING
实验问题 | 原因 | 推荐解决方法 |
过表达基因的腺病毒进行包装后得率很低？ | 包装细胞状态不佳 | 请选择状态良好，代数较早的293细胞。 |
目的基因片段过长 | 对于3000bp以上的基因建议不要增加IRES-EGFP标记，并在后续实验增大皿数。 | |
腺病毒扩增后得率很低？ | 病毒原液质量不佳或滴度过低 | 适当扩增一两代后再进行大扩。 |
带有 EGFP 荧光标记的腺病毒感染细胞后无荧光？ | 表达框不正确 | 确认外源基因与 EGFP 的表达框是否无误 |
细胞状态不佳 | 确认细胞状态良好，并摸索合适的MOl植。 | |
带有 EGFP 荧光标记的腺毒感染目的细胞后无荧光很弱？ | 目的基因片段过长 | 片段过长影响共表达的EGFP荧光，建议观察GFP阴性对照腺病毒的感染效率。 |
细胞状态不佳 | 确认细胞状态不好，并摸索合适的MOl值。 | |
过表达基因的腺病毒感染目的细胞后WB检测过表达不明显？ | 表达框不正确 | 确认过表达基因的腺病毒载体表达框正确，未发 生提前终止。 |
细胞状态不佳 | 确认细胞状态良好，并摸索合适的MOI值。 | |
干扰腺病毒感染靶细胞后qPCR检测干扰效果不佳？ | 未经验证的干扰靶点 | 确认靶点是否经过验证，若无效需重新设计干扰靶点 |
细胞状态不佳 | 确认细胞状态良好，并摸索合适的MOI值。 |
常见问题 FAQ
Q: 客户提供 RNAi 靶点进行腺病毒包装要注意哪些要点？
A：客户提供的 RNAi 靶点序列，需明确该靶点在靶细胞的 RNAi 效率是否经过客户验证。如果是客户从文献
中查询到的 shRNA 干扰靶点序列，其在靶细胞的干扰效率能否达到客户要求具备一定风险，建议可进行小量
包装验证后再进行大量包装实验。若客户无法提供 RNAi 靶点，建议客户在我公司进行 RNAi 靶点的设计和筛
选工作，将筛选得到的最佳靶点进行腺病毒包装工作。
Q : 腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？
A：有要求。一般基因长度超过 3000bp 的基因在载体重组过程中难度已经加大，且会影响腺病毒的出毒效率。
Q: 腺病毒发货前进行哪些质检工作？
A：发货前我们会对腺病毒的滴度进行检测，采用的方法为 TCID50 方法（单位为 TCID50/ml），严格按照客户的要求的滴度进行发货；对于过表达目的基因的腺病毒，我们会将其感染 293 细胞，qPCR 检测过表达目的
基因的表达丰度。
Q : TCID50 法检测腺病毒滴度的操作过程及周期？
A：96 孔板中接种 293 细胞后，用 DMEM 将病毒液稀释成 8 个浓度（如 10-3-10-10），每个浓度重复 10 孔，每孔加入病毒稀释液 100μl，37℃培养 10 天，观察细胞，根据细胞病变率计算滴度值。注意滴度检测操作时间长, 需要感染病毒后 10 天才能观察和计算结果 , 需客户耐心等待准确的滴度测定结果。
Q:腺病毒的单位 VP、PFU 和 IU 各是何含义？
A：VP：病毒颗粒数（viral particle），是具备感染能力和不具备感染能力的腺病毒颗粒的总量。
PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染能力的腺病毒的总量，即腺病毒的活性单位。
IU：感染单位（infectious unit），是腺病毒活性单位，测定方法是TCID50法。
Q : 订制的腺病毒产品接收后如何保存和使用？
A：我们采用干冰特快专递方式递送到客户手中。客户收到后，应注意以下几点：
1）确认泡沫塑料盒中的干冰仍有剩余，冰盒内保持低温；2）确认泡沫塑料盒内物品与发货样本清单一致，腺病毒产品包装完整，没有破碎、渗漏；3）公司提供分装好的腺病毒产品，短时间内不使用请冻存于 -80℃超低温冰箱中。半年内使用完毕。4）冻存于 -80℃超低温冰箱中的腺病毒产品使用前取出,后在室温下解冻，解冻后放在冰浴中，并尽快使用。如果解冻后的病毒暂时用不完，滴度足够高时（比如 1011~12TCID50/ml），4℃可保存 1~2 周。5)若每次用量很少，可对腺病毒进行分装。
Q 包装好的病毒在使用中要注意哪些安全性问题？
A：腺病毒的使用要求在生物安全标准 2 级 (BL2) 的实验室进行，操作人员穿工作服、戴口罩及一次性乳胶手套。操作时应在指定的区域内使用 II 级生物安全柜；操作时动作尽量轻柔，避免产生气溶胶和飞溅；含有腺病毒的废液和用具可用 121℃高压灭菌 30 分钟；使用锐器（如注射器、刀片）时务必要小心。
Q : 腺病毒可以浓缩或稀释吗？方法如何？
A：可以浓缩：浓缩后的滴度以不超过 3×1012v.p/ml 为宜，过浓可能导致病毒聚集而产生沉淀。可以稀释：可采用PBS、生理盐水、DMEM等进行稀释，稀释后的样品尽量一次用完，在没有保护剂的情况下，腺病毒在 2 ～ 8℃保存时间不能超过一周。
Q : 用于体内试验的腺病毒，是否要求纯化？
A：体内实验腺病毒纯化是很必要的：因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒 fiber 和 penton 蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会引起宿主强烈的免疫反应。另外，纯化的作用还可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中。
Q :小鼠体内注射腺病毒，一只小鼠大概需要多少量？腺病毒对小鼠的半数致死剂量（LD50）大概是多少？
A：我们建议的腺病毒用量范围在 108-10IU/ 只小鼠，客户需进行预实验摸索正确的使用剂量。小鼠肌注腺病毒后，3~4 天目的蛋白的表达达到高峰，一周后逐渐下降，持续表达时间在两周左右。静脉注射小鼠（昆明鼠），半数致死剂量 LD50 大约为 1×1011v.p./ 只；裸鼠和 SCID 鼠（严重联合免疫缺陷小鼠）可能更敏感一些。肌注方式的 LD50 未测到：1×1012v.p./ 只给药，未发现小鼠死亡。
Q : 可以更换特异性启动子后进行腺病毒包装吗？
A：可以。常规采用 CMV 启动子可以获得理想的表达，若需要采用特异性启动子进行腺病毒包装，建议验证该启动子介导的表达效率后，再进行腺病毒特异性启动子载体的构建及包装工作。
参考文献
1. Kozarsky, K. F., and Wilson, J. M. (1993). Gene Therapy: Adenovirus Vectors. Curr. Opin. Genet. Dev. 3,
2.Russell, W. C. (2000). Update on Adenovirus and its Vectors. J. Gen. Virol. 81, 2573-2604.
3.Wang, I. I., and Huang, I. I. (2000). Adenovirus Technology for Gene Manipulation and Functional Studies. Drug
Discovery Today 5, 10-16.
