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腺相关病毒(AAV)是一种人细小病毒，目前因为能作为一种基因治疗载体而受到广泛关注。构建重组AAV(rAAV)涉及到用一个目的基因替换病毒基因组的大部分，然后将这个重组基因组包装到一个有感染性的病毒颗粒里。目前大多数生成rAAV的实验方案需要共转染一个载体质粒和一个表达病毒复制和结构基因的包装质粒到腺病毒(Ad)感染的培养细胞中。此方法的局限性包括(1) Ad辅助病毒污染rAAV，(2)rAAV的低产出，(3)生成有复制能力的AAV。在此我们描述了新的辅助质粒(pH3和pH5)，排除了Ad共转染的需求。辅助质粒表达AAV的rep和cap基因和Ad E2A、VAI和E4基因。当辅助质粒在没有Ad感染的情况下共转染到人293细胞中，rAAV载体产量超过了pAAV/Ad包装质粒的80倍。另外，有复制能力的AAV在rAAV制备过程中少于0.00125%。此系统的主要优点是(1)无需感染性的腺病毒(2)只使用两个质粒就提高了转染效率和载体的产出。我们相信该双质粒转染系统因其简便性和高产出而使AAV载体系统能被更广泛地使用。该系统尤其将对多rAAV载体的临床前分析有用。
| 一、腺相关病毒（AAV）载体 | 二、腺相关病毒（AAV）干扰载体 |
| ●广泛用于体内实验研究（定点注射与整体注射） | ●广泛用于体内实验研究（定点注射与整体注射） |
| ●表达稳定高效；非整合，转基因安全性高 | ●表达稳定高效；非整合，转基因安全性高 |
| ●CMV, EF1a, CAG，GBG, Syn 等启动子可选 | ●构建快捷，序列保证准确 |
| ●EGFP、mCherry等荧光蛋白可选 | ●标记基因可采用EF1a或GBG启动子表达，稳定高效 |
| 三、腺相关病毒包装与纯化 | ||
| ●腺相关病毒包装采用三质粒系统进行包装，共转染后通过对细胞裂解物进行密度梯度离心纯化和收集病毒。 | ||
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| 四、腺相关病毒滴度检测 | 五、腺相关病毒感染细胞 |
| ●检测方法：定量PCR检测病毒基因组中的外源DNA拷贝数 | ●对于特定细胞有较高的感染率，如心肌和血管内皮细胞 |
| ●实验原理：腺相关病毒的基因组为单链DNA | ●感染温和，表达稳定长效 |
六、腺相关病毒定位注射 ●感染范围广，可以用于神经系统、眼睛、心肌、肝脏、肌肉和肺部定位注射或定向给药 ●滴度高，颗粒小，扩散能力强 ●表达稳定，可持续半年以上 ●外源基因定向重组，免疫原性低，极少发生非特异反应和免疫抑制，适合于进行基因治疗研究 |
rAAV定位注射脑皮层区域进行基因沉默 Nature medicine, 2013, 19(6): 773-777. |
| 七、中枢神经AAV注射 |
rAAV定位注射纹状体进行基因沉默 PloS one, 2013, 8(6): e64637. |
立体定位注射 12 周龄SD 雄性大鼠实验前麻醉。注射时， 将27 号针头用26 号内径的塑料管和10μl 汉米尔顿注射器（由微量注射泵推动）连接在一起，每分钟注入病毒0.2μl，每次3μl。定位海马的坐标是前囟后3.6mm，侧向2.0mm，背向2.8mm。每当针头定位后或是准备拔出前都停留1min。 | |
| 八、视网膜下AAV 注射 | |
12小鼠用3%异氟醚麻醉，用30 号注射针在接近晶状体的巩膜上切开一个小口，通过这个小孔，用5μl 汉密尔顿注射器（连接微量进样装置）将2μl AAV 病毒缓慢（20-30s内）注入视网膜下。动物选择P21以后的小鼠。从病毒注射到后期实验中间至少休息3个星期。需要进行行为学实验的，两只眼睛都要感染相同的病毒。 |
| 九、整体注射 整体注射是最接近临床治疗方式的实验方法。一般地，利用病毒进行整体注射主要通过胚胎注射、肌肉注射和静脉注射等方式。实验研究发现，对于大部分病毒而言，在动物的肝脏、肾脏和胰脏积累较多；或者通过缺血再灌注等方式，也可以实现心脏的病毒感染。而rAAV病毒作为一种细小病毒，颗粒小，免疫原性低，已经广泛用于整体实验并获得了积极的效果，成为整体实验研究中日趋突出的病毒工具。 病毒的整体注射对病毒滴度和体积有较为严格的要求，滴度低的病毒会造成感染和表达减弱甚至根本无法感染；滴度过高或杂质过多的病毒会引起免疫反应造成动物死亡。作为免疫原性最低的AAV病毒载体，其在不同组织中的感染活性与血清型有着密切关系。其滴度范围一般在1012v.g./ml以上。一般认为，为了增强在某一组织中的表达，采用组织特异启动子可以达到更好的效果。 |
rAAV整体注射肝脏感染效果 | |
