RNAi病毒包装及筛选技术服务
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实验原理

  与化学合成的siRNA和shRNA质粒载体相比,利用慢病毒或腺病毒表达shRNA,一方面可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞,提高shRNA导入细胞的效率,另一方面病毒介导可延长RNAi的时间,尤其慢病毒感染后可以整合到宿主细胞基因组,进行稳转筛选。

图2.4慢病毒介导RNAi原理示意图


技术应用

技术应用基因功能的体内外研究

病理机制研究


实验流程



实物数据信息实验周期
客户提供靶细胞目的基因NCBI登陆号,细胞培养信息11-12周
我们提供RNAi载体/菌株 基本实验步骤,细胞照片,病毒包装实验报告、RNAi筛选实验报告


实验结果展示

图 1 相对定量 PCR 检测 3 组 shRNA 慢病毒感染组相对阴性对照组目的基因的干扰效果


TPOUBLESHOOTING

实验问题

原因

推荐解决方法

干扰病毒感染靶细胞后qPCR干扰效果不佳?

感染效率低

确定细胞状态良好;采用合适的病毒MOI值,

感染效率80%以上。

干扰病毒感染后对细胞毒性较大?

靶基因的功能

阴性对照病毒如果对细胞毒性无影响则说明

靶基因的功能对细胞的增值是必需的。

干扰病毒感染后的稳转株构建失败?

靶基因的功能

如果阴性对照稳转株可以构建成功说明靶基

因的功能对细胞的增值是必需的。


常见问题 FAQ

Q :化学合成siRNA,shRNA质粒和shRNA病毒进行细胞实验的优缺点?

常见的 RNAi 载体 / 方法

优点

缺点

化学合成 siRNA 转染细胞

化学合成方便快捷,周期短。

可以进行动物体内实验研究。

干扰效果容易受到细胞转染效率

 的影响;siRNA 很快被细胞外排

扰效果保持的时间不能超过

          3 天。

shRNA 质粒转染细胞

载体构建方便,可以进行扩增,

避免了 RNA 操作中的特殊

求,且质粒载体上可以带有

EGFP 荧光标记和筛选标记。

很多肿瘤、原代细胞转染效

率很低,不能得到很好的干

   扰效果。


shRNA病毒感染细胞

通过慢 / 腺病毒介导可以有效感染

靶细胞 80% 以上,干扰效果达到

70% 以上。其中慢病毒介导的

shRNA 能整合入靶细胞的基因组

中,可进行稳定株筛选工作。

病毒包装的费用相对 siRNA 和

shRNA 有所提高,包装周期要长

siRNA 合成及 shRNA 载体构建。


Q :我提供靶细胞为什么需进行预实验?需检测哪些内容?

A 客户提供的靶细胞进行培养后确定其状态,我们会进行靶基因的表达丰度检测,确认靶基因的表达量,然后采用慢病毒或腺病毒进行细胞的 MOI 值摸索,确认靶细胞用何种病毒预计采用多大的病毒量进行感染实验。若预实验结果表明细胞中靶基因的本底表达本身很低则不建议进行干扰筛选工作。


Q :病毒介导的RNAi筛选工作公司作何保证?

A:首先预实验摸索客户提供靶细胞的 MOI 值,感染效率达到 80% 以上,从而确定病毒的包装类型。然后设计三个干扰靶点并进行病毒包装工作,感染靶细胞后,我们通过 qPCR 检测,确保至少一个靶点的干扰效果大于80%。实验结束后最佳干扰靶点的腺病毒可根据客户的要求进行扩增;最佳干扰靶点的慢病毒可以根据客户的要求大量包装后提供给客户。


参考文献

1. Buchschacher GL Jr, Wong-staal F. Development of Lentiviral Vectors for Gene Therapy for Human Diseases.Blood2000,95(8):2499-2504.