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实验原理
细胞免疫化学与免疫组织化学实验都是依据抗原抗体反应和化学显色的原理，采用标记的特异性抗体对组织或细胞内抗原的分布进行原位检测技术。细胞免疫化学将培养处理后的细胞爬片、固定、破膜、封闭后，加入一抗与抗原蛋白结合，再加入标记有荧光素的二抗与一抗进行反应，最后通过激光共聚焦扫描显微镜进行荧光拍摄来显示细胞中靶蛋白的表达变化和定位。
激光共聚焦扫描显微镜（Confoccal Laser Scanning Microscope, CLSM）是现在最先进的细胞生物医学分析仪器之一，采用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬间成像的物点。从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
技术应用
检测靶蛋白如内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物。
实验流程
| 实物 | 数据信息 | 实验周期 | |
| 客户提供 | 细胞株（冻存株或培养细胞） 及所需药品，抗体 | 细胞培养信息和药物处理方式 | 3周 |
| 我们提供 | 剩余药品、抗体 | 基本实验步骤、Confocal各色 荧光照片 |
实验结果展示
图1 细胞目的蛋白的confocal拍摄照片
A：细胞白光照片;B：标记红色荧光的目的蛋白；C：标记绿色荧光的目的蛋白；
D：DAPI进行核染；E：A-D图片的重叠图片。
TROUBLESHOOTING
实验问题 | 原因 | 推荐解决方法 |
荧光信号背景很高？ | 一抗质量不佳 | 选用特异性和效价更高的抗体。 |
抗体浓度太高 | 注意调整一抗和二抗的稀释比例。 | |
封闭不完全 | 改善封闭条件。 | |
洗涤不充分 | 充分洗涤。 | |
荧光信号较弱？ | 目的蛋白表达量过低 | 可以设置表达量较高的阳性细胞作为对照。 |
细胞破膜效果不佳 | 采用合适的通透剂或采用甲醇固定无需通透。 | |
一抗稀释度过大 | 需进行预实验摸索一抗稀释比例。 | |
二抗选择错误 | 使用能正确识别一抗的二抗。 |
常见问题FQA
Q：哪些荧光染料常用于细胞免疫荧光检测？
荧光染料名称 | 最大吸收光谱 | 最大发射光谱 |
异硫氰酸(Fluorescein lsothiocyanate, FITC) | 490～495nm | 520～530nm,呈翠绿色荧光 |
四甲基异硫氰酸罗丹明（Tetramethyl Rhodamine lsothiocyanate, TRITC） | 550nm | 620nm,橙红色荧光 |
四乙基罗丹明（RB200） | 570nm | 595～600nm，呈橙红色荧光 |
德克萨斯红（Texas Red） | 596nm | 620nm，红色荧光 |
CY3 | 544nm | 568-574nm，呈鲜红色荧光 |
碘化丙啶(Propidium lodide, PI) | 493nm | 630nm，呈红色荧光 |
4’ ,6-e二脒基-2-苯基吲哚（4‘ ，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI） | 358nm | 461nm，蓝色荧光 |
Q：怎样选择二抗标记的荧光？
A :二抗标记的荧光颜色的选择非常重要，要求在实验前根据现有材料和仪器的局限性设计好实验方案，一般我们进行三种颜色的标记工作。目前细胞核染料常用PI（红色）或DAPI（蓝色），如果细胞中还表达EGFP（绿色），则需要选用其他颜色的荧光素来标记目的蛋白，不得已的情况下采用颜色相近，后期也要用光谱拆分技术对图片进行处理（需专业人员进行，不建议采用相近颜色）。
Q：怎样选择细胞免疫化学爬片所用的固定剂？
固定剂种类 | 原理 | 优点 | 缺点 | 应用对象 |
有机溶剂 （甲醇） | 强烈脱水变性蛋白，并可溶解脂类物质产生通透效应 | 蛋白变性完全，对抗原的保存性好，能充分暴露出抗原，无需通透处理 | 不易保存细胞形态，细胞可能呈扁平状 | 细胞结构抗原、酶类抗原 |
交联剂 （多聚甲醛） | 导致细胞内分子相互连接呈网状结构，并维持在原位上 | 更易于保持细胞的结构 | 交联产生的阻碍可能会降低细胞组分的抗原性，需要通透处理 | 细胞膜相关组分蛋白 |
Q：做细胞免疫荧光大概提供多少抗体合适？
A：细胞免疫荧光实验我们需先进行预实验采用普通荧光显微镜进行观察，确认实验条件后再进行Confocal拍摄的正式实验。确认实验条件后再进行Confocal拍摄的正式实验。24孔板的细胞爬片在进行一抗37℃孵育时，一般加入200ul经BSA稀释的一抗，其稀释倍数需参考抗体说明书，如稀释倍数为1：100则每张爬片需要2ul（进行细胞免疫荧光的一抗稀释倍数要比WB的小）。注意提供的抗体量需满足预实验和正式实验所需的量。
Q：激光共聚胶显微镜拍摄除用于细胞免疫荧光拍摄外还可以进行哪些检测？
A：由于各种荧光标记探针的应用，通过对荧光探针分布和荧光强度的分析，Confocal实验还可以用于进行细胞内游离钙、线粒体膜电位、活性氧、细胞膜流动性、细胞结构等实验结果的拍摄和分析工作。根据客户对细胞处理的要求并且购买合适的探针试剂盒，我们也可以为您进行您实验所需的Confocal拍摄工作。
参考文献
1. Davia LS,R obert DG.Metho ds in Microscopy:Protocols And Concepts from Cells, a Laboratory Manual [M].CSHLPress,2006.
2. Douglas JT, Brooke TM. Cell imaging techniques: methods and protocols[M].Springer,2006.
