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实验原理
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）是指基因组上单个核苷酸的变异，人类基因组平均每1000个就有一个SNP。它是由基因组DNA某一特定核苷酸位置上单个碱基的转换、颠换、插入或缺失引起的点突变，使得群体之间和个体之间产生了差异。其中转换和颠换发生频率较高，转换是指同型碱基之间的转换，即嘌呤与嘌呤、嘧啶与嘧啶间；颠换是指发生在嘌呤与嘧啶之间的替换。事实上转换的发生频率占多数，且CG序列上出现的SNP最为频繁，而且多是C转换为T（见图5.5），原因是CG中的C常因为甲基化自发地脱氨基后即成为T。
图5.5SNP转换示意图（C转化为T）
技术应用
SNP作为第三代遗传标记，在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体疾病易感性分析与药物基因组学的研究中发辉了重要的作用。除医学研究外，SNP已逐渐涉及遗传学、生态学、作物育种众多邻域。研究对象也由人类扩展到有重要经济价值和研究价值的动植物、微生物等。
实验流程
实物 | 数据信息 | 实验周期 | |
客户提供 | 待测样本 | 待测序列SNP位点信息 | 5周 |
我们提供 | 无 | 基本实验步骤、测序报告 |
实验结果展示
图5.6基因组DNA抽提电泳图 图5.7目的基因的PCR扩增电泳结果
图5.8目的基因SNP测序结果
TROUBLESHOOTLNG
实验问题 | 原因 | 推荐解决方法 |
基因组DNA电泳条带弥散？ | 样本降解 | 重新抽提基因组DNA。 |
无法扩增到目标条带？ | PCR反应条件不佳 | 优化PCR反应条件，如提高酶量，降低退火温度。提高模板量等。 |
测序结果双峰或乱峰，无法分析? | 样本不纯 | PCR产物必须采用胶回收，确保无非特异性条带及引物残留。 |
常见问题FAQ
Q ：常见的SNP测定方法有哪些，优缺点是什么？
常见方法 | 优点 | 缺点 |
PCR测序法 | SNP分析的金标准，可发现未知SNP位点。 | 每个位点均需要PCR扩增测序，成本较高，工作量大周期长，不适合大样本做疾病关联分析，且容易发生交叉污染。 |
Taqman探针法 | 适合已知SNP位点、位点数量少、通量高的检测，结果直观清晰，实验闭管进行，因而减少了PCR污染的风险。 | 探针合成费用高，周期稍长，不能发现未知SNP位点。 |
PCR-RFLP法 | 判断依据酶切后产生片段的大小和数目的变化，技术简便，价格便宜，仅使用已知SNP判断，事宜少量样本的实验室检测。 | 费时费力，灵敏度差；仅能检测有酶切位点的SNP，不能确定何种SNP，无酶切位点不能检测；需要凝胶电泳，DNA链二级结构容易造成人工假相，使结果出现偏差。 |
连接酶检测反应 | 适用于任何多态性位点，不需要人工引入酶切位点；分型准确，其准确度可达99%以上；检出率高，周期短。适宜100-3000个样品，1-20个位点。 | 需进行多重PCR，多重LDR以及 ABl3730XL检测。 |
芯片技术 | 与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点。 | 仅适用于全基因组SNP扫描，不适宜单个基因的SNP位点检测，精度低，价格昂贵。 |
飞行时间质谱 （MALDL-TOFMS）法 | 检测速度快，理论上能分析单个碱基的 变化。 | 纯物理加成易受到样本因素的多种干扰，精确度难以保证。适宜于已经优化的特定SNP检测，检测过程需要多点质控，否则精确度很低。 |
Lllmina光纤微 珠芯片技术 | 起始样品量要求很低，还能够检测多个感兴趣的区域，从而检出罕见的基因突变。 | 高通量SNP检测，用于SNP在全基因组 上的扫描分析，价格昂贵。 |
HRM技术 | 高通量、简单、快速、省钱、高灵敏度；闭管检测，避免污染造成的假阳性；扩增区内已知和未知SNP都能检测；灵敏度和精确度达到进100%。 | 目前仅有少数公司可以提供该项服务。 |
Q ：如何提供待检测的SNP位点信息？
A ：关于SNP位点的分析，可根据参考文献给出RS号或者指定的一段基因序列，并标明SNP位点。以RS号rs1799946为例，可在NCBL网站SNP选项中搜索出相关位点信息如下：
A G C C T C T G T C A G C T C A G C C T C C A A A G
[A/G]AGCCAGCCTCTCCCCAGTTCCTGAA
HGVS Names:[NM_005218.3:c.-52G>A]
HGVS是Human Genome Variation Society(人类基因组变异协会)的简称，HGVS命名SNP法的规则是标出引用的核酸序列号（Reference Sequence,RefSeq）和SNP在该核酸序列中的位置，其中NM_005218.3是该核酸序列中的位置，G>A表示原始碱基是G，突变碱基是A。
Q ：如何确定一个碱基的变异是突变还是SNP呢？
A ：人群中的变异几率大于等于1%则可称之为多态性，小于1%则为突变。通过群体样本的变异几率的数据分析可以判断是突变还是SNP。
Q ：纯合子、杂合子可否通过SNP测序法检测到？
A ：每个SNP只有两个等位基因，因此存在纯合子（是指同一位点上的两个等位基因相同的基因型个体，如AA）和杂合子（是指同一位点上的两个等位基因不相同的基因型个体，如Aa）的可能。通过测序所得的峰图结果可以分辨是纯合子还是杂合子，如图5.9所示：
图5.9纯合子和杂合子SNP测序结果示意图
参考文献
1. Erichsen HC,Chanock SJ. SNPs in cancer research and treatment.Br J Cancer 2004,90(4):747-51.
